Dados do Trabalho

Título/Title/Titulo

Avaliação da cinética e das alterações morfológicas da fusão de esferoides de células-tronco/estromais de tecido adiposo humano.

Introdução/Introduction/Introdución

A fusão de esferoides é um processo fundamental para a biofabricação de tecidos e fornece um modelo simplificado de análise de formação de tecidos, uma vez que pode ser quantificado com maior facilidade e com maior rendimento do que em tecidos complexos. A compreensão e otimização do processo de fusão tecidual é essencial para construir tecidos e órgãos a partir de esferoides individuais.

Objetivos - Metodologia - Resultados - Discussão dos Resultados/Objectives - Methodology - Results - Discussion of Results/Objetivos - Metodología - Resultados - Discusión de los resultados

O objetivo deste trabalho é avaliar o processo de fusão de esferoides de células-tronco/estromais de tecido adiposo humano no seu estado indiferenciado e diferenciado para a via osteogênica, através de um análise cinética e morfológica. Para isso, as células foram semeadas em hidrogéis de agarose (2x106 células/hidrogel) previamente moldados com 81 microrressecções a partir de um molde de silicone, conforme recomendações do fabricante (Microtissues, Inc.). Os esferoides formados foram mantidos em meio de cultivo composto por albumina 1,25µg/ml, ácido ascórbico 50µg/mL, insulina 0,01 mg/ml, transferrina 0,01mg/ml selênio 0,01µg/ml e penincilina 100UI/ml e estreptomicina 100µg/ml (esferoides indiferenciados) ou em meio de indução de diferenciação (meio condrogênico por 2 semanas composto de Dexametasona 10-8mM e TGFβ-3 10ng/mL seguido de meio osteogênico por 3 semanas composto de β-glicerofosfato 10mM e Dexametasona 10-7mM - esferoides diferenciados) por até 5 semanas. Após este período, os esferoides foram coletados e delicadamente dispostos em poços de placa de 96 poços previamente recobertos com agarose. Quatro esferoides por poço foram dispostos em proximidade uns com os outros e mantidos em estufa úmida a 37o.C e atmosfera com 5% de CO2. A partir daí, o processo de fusão de esferoides indiferenciados e diferenciados foi acompanhado por microscopia óptica de contraste de fase, obtendo-se fotos nos tempos de 0 e 3 horas, bem como de 1, 2, 3, 6 e 7 dias após o plaqueamento para a fusão, com auxílio de um microscópio invertido, acoplado a uma câmera e do software Axiovision LES4. O processo de fusão foi avaliado após 3 e 7 dias do plaqueamento para a fusão através de análises histológicas realizadas em cortes corados por hematoxilina e eosina. Sete dias após o plaqueamento, o processo de fusão também foi avaliado por microscopia eletrônica de varredura. Em todos os poços avaliados, observou-se que os esferoides indiferenciados fusionaram-se mais rapidamente do que os esferoides diferenciados. No 3o. dia após o plaqueamento da fusão, os esferoides indiferenciados encontravam-se parcialmente fusionados, enquanto que os esferoides diferenciados encontravam-se apenas com contato superficial.

Considerações Finais/Final considerations/Consideraciones finales

Os esferoides indiferenciados apresentaram ainda uma subpopulação de células morfologicamente distinta orientada para a região de fusão dos esferoides. Ao final de 7 dias do plaqueamento da fusão, foi observado que os esferoides induzidos apresentaram-se pouco fusionados, porém com projeções interligando-os em pontos onde os esferoides não se encontravam interligados anteriormente. Portanto, a capacidade de fusão de esferoides induzidos à diferenciação osteogênica é inferior à capacidade dos esferoides indiferenciados. A presença de projeções entre os esferoides induzidos dispostos em aproximação para a fusão sugere um mecanismo de fusão diferente do que ocorre com os esferoides indiferenciados. Avaliações de viabilidade dos esferoides após a fusão estão em curso, bem como análises quantitativas da cinética de fusão.

Palavras-chave/Key words/Palabras clave

engenharia de tecidos, fusão, esferoides, biofabricação